Fracionamento celular
O fracionamento celular é uma técnica utilizada para isolar ou purificar componentes celulares enquanto preserva as funções individuais de cada componente.[1] Este é um método que foi originalmente usado para demonstrar a localização celular de vários processos bioquímicos. O fracionamento celular permite aos pesquisadores preparar componentes celulares específicos em volume e identificar suas funções, tarefa bem mais difícil com células intactas.[2]
Homogeneização[editar | editar código-fonte]
A primeira etapa para o fracionamento corresponde à lise celular (rompimento da membrana plasmática), para que os componentes celulares sejam liberados.[2] Isto é feito em condições que minimizam os danos às organelas delimitadas por membrana.[3] Os mecanismos de homogeneização podem ser feitos de diversas maneiras, como exposição a sons de alta frequência (sonicação), tratamento com um misturador de alta velocidade, trituração em um homogeneizador mecânico, cavitação de nitrogênio,[3] alterações de pressão, choque osmótico, congelamento e descongelamento, etc. Geralmente, é necessário monitorar o processo via microscopia de contraste de fase, para evitar a ruptura das organelas ou desorganização das estruturas citoplasmáticas.[3]
A solução resultante (homogenato ou extrato) contém as moléculas grandes e pequenas circulantes no citosol, assim como todas as organelas delimitadas por membrana.[2] As amostras são então refrigeradas para evitar que suas enzimas sejam danificadas.
Filtração[editar | editar código-fonte]
A filtração não é sempre necessária, a depender da origem das células. Em alguns casos, como em tecidos animais, geralmente é necessário filtrar o homogenato, a fim de separar das organelas fragmentos grandes de célula ou tecido, como tecido conjuntivo.[4][5] Assim, a partir do homogenato bruto, os resíduos celulares e os fragmentos de tecido conjuntivo são removidos por filtração, com o uso de uma gaze ou filtro de sucção.
Purificação[editar | editar código-fonte]
Uma vez que as células são quebradas, a suspensão pode ser separada em seus componentes principais usando dois métodos diferentes de purificação: a centrifugação diferencial e a centrifugação por gradiente de densidade.
Centrifugação diferencial[editar | editar código-fonte]
A centrifugação diferencial consiste em uma série de centrifugações em velocidades crescentes que separam os componentes com base em sua taxa de sedimentação. As partículas mais pesadas e mais densas se depositam no fundo do tubo, formando um pellet (pequenas partículas), a uma taxa em função de seu tamanho e densidade.[6] O sobrenadante é então coletado e submetido a uma centrifugação adicional, dessa vez em velocidade mais alta, e o processo pode ser repetido várias vezes dependendo do tipo de célula e as estruturas a serem isoladas.[3]
Em alguns casos, a centrifugação diferencial não produz material puro, sendo necessário realizar mais um procedimento de isolamento, dessa vez pela centrifugação em gradiente de densidade.[3]
Centrifugação em gradiente de densidade[editar | editar código-fonte]
A centrifugação em gradiente de densidade baseia-se na sedimentação dos componentes celulares em um gradiente de densidade,[2] composto de soluções de diferentes densidades (sacarose, ficoll, etc). O tubo é centrifugado por um período prolongado, permitindo que cada estrutura migre para uma posição de equilíbrio, onde a densidade da estrutura seja igual à do líquido circundante. Portanto, neste processo, a separação é baseada na densidade, e não no tamanho e na forma das partículas.[3] Após a centrifugação, as frações podem ser coletadas individualmente para posterior análise e determinação da eficiência da separação.
A centrifugação por gradiente de densidade pode ser subdividida em dois tipos principais, taxa zonal e isopícnica. A principal diferença entre os dois é que, na isopícnica, um gradiente de alta densidade é usado e as células são separadas apenas por diferenças de densidade. Na taxa zonal, um gradiente de densidade inferior é usado e as células são separadas principalmente por diferenças de tamanho.[7]
Ver também[editar | editar código-fonte]
Referências[editar | editar código-fonte]
- ↑ Alberts, B; Johnson, A. «Fractionation of Cells». Molecular Biology of the Cell. 4th edition.
- ↑ a b c d Alberts, B; et al. (2017). Fundamentos da Biologia Celular. [S.l.]: Artmed Editora. ISBN 978-85-8271-406-5
- ↑ a b c d e f Souza, Wanderley de; Cunha-e-Silva, Narcisa Leal da (março de 2003). «Cell fractionation of parasitic protozoa: a review». Memórias do Instituto Oswaldo Cruz (em inglês) (2): 151–170. ISSN 0074-0276. doi:10.1590/S0074-02762003000200001. Consultado em 14 de outubro de 2020
- ↑ Work, T. S.; Work, E., eds. (1 de janeiro de 1979). «Chapter 2 Methods of cell breakage: assessing their suitability and efficacy». Elsevier (em inglês): 11–44. Consultado em 14 de outubro de 2020
- ↑ Ramakrishnan, S. (outubro de 2004). Textbook of Medical Biochemistry (em inglês). [S.l.]: Orient Blackswan
- ↑ «FRACCIONAMENTO CELULAR». materiais.dbio.uevora.pt. Consultado em 14 de outubro de 2020
- ↑ Burdon, R. H.; Knippenberg, P. H. van; Sharpe, Paul T, eds. (1 de janeiro de 1988). «Chapter 3: Centrifugation». Elsevier. Methods of Cell Separation (em inglês): 18–69. doi:10.1016/s0075-7535(08)70628-4. Consultado em 14 de outubro de 2020
