Produção de proteína

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Central dogma depicting transcription from DNA code to RNA code to the proteins in the second step covering the production of protein.
Dogma central que descreve a transcrição do código de DNA para o código de RNA para as proteínas na segunda etapa, cobrindo a produção de proteína.

Produção de proteína é o processo biotecnológico de gerar uma proteína específica. É tipicamente alcançado pela manipulação da expressão gênica em um organismo, de modo a expressar grandes quantidades de um gene recombinante. Isso inclui a transcrição do DNA recombinante para o RNA mensageiro (mRNA), a tradução do mRNA em cadeias polipeptídicas, que são finalmente dobradas em proteínas funcionais e podem ser direcionadas (endereçadas) para locais subcelulares ou extracelulares específicos.[1]

Sistemas de produção de proteínas (no jargão de laboratório, também conhecido como 'sistemas de expressão') são usados nas ciências da vida, biotecnologia e medicina. Pesquisa em biologia molecular usa inúmeras proteínas e enzimas, muitas das quais são de sistemas de expressão; particularmente DNA polimerase para reação em cadeia da polimerase (RCP), transcriptase reversa para análise de RNA, endonucleases de restrição para clonagem e para produzir proteínas que são rastreadas na descoberta de drogas como alvos biológicos ou como drogas em potencial. Também existem aplicações significativas para sistemas de expressão em fermentação industrial, notadamente a produção de produtos biofarmacêuticos, como a insulina humana para tratar diabetes e para fabricar enzimas.

Sistemas de produção de proteínas[editar | editar código-fonte]

Os sistemas de produção de proteínas comumente usados incluem os derivados de bactérias,[2] leveduras,[3][4] baculovírus/insetos,[5] células de mamíferos,[6][7] e mais recentemente fungos filamentosos tais como Myceliophthora thermophila.[8] Quando os produtos biofarmacêuticos são produzidos com um desses sistemas, as impurezas relacionadas ao processo denominadas proteínas da célula hospedeira também chegam ao produto final em pequenas quantidades.[9]

Sistemas baseados em células[editar | editar código-fonte]

Os sistemas de expressão mais antigos e mais usados são baseados em células e podem ser definidos como "combinação de um vetor de expressão, seu DNA clonado e o hospedeiro do vetor que fornecem um contexto para permitir a função de genes estranhos em uma célula hospedeira, ou seja, produzir proteínas em alto nível".[10][11] A sobre-expressão é um nível anormal e excessivamente alto de expressão genética que produz um gene pronunciado relacionado a fenótipo.[12][13]

Existem muitas maneiras de introduzir DNA estranho para uma célula para expressão, e muitas células hospedeiras diferentes podem ser usadas para expressão — cada sistema de expressão tem vantagens e responsabilidades distintas. Os sistemas de expressão são normalmente referidos pelo hospedeiro e a fonte de DNA ou o mecanismo de entrega do material genético. Por exemplo, hospedeiros comuns são bactérias (tais como E. coli, B. subtilis), leveduras (tais como S.cerevisiae[4]) ou linhas celulares eucarióticas. Fontes comuns de DNA e mecanismos de entrega são vírus (tais como baculovírus, retrovírus, adenovírus ), plasmídeos, cromossomos artificiais e bacteriófagos (tais como lambda). O melhor sistema de expressão depende do gene envolvido, por exemplo o Saccharomyces cerevisiae é frequentemente preferido para proteínas que requerem significativa modificação pós-traducional. Linhagens celulares de insetos ou mamíferos são usadas quando emendas de mRNA é necessário. No entanto, a expressão bacteriana tem a vantagem de produzir facilmente grandes quantidades de proteína, o que é necessário para experimentos de cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear para determinação da estrutura.

Devido as bactérias serem procariotas, eles não estão equipados com a maquinaria enzimática completa para realizar as modificações pós-traducionais necessárias ou o dobramento molecular. Portanto, proteínas eucarióticas de múltiplos domínios expressas em bactérias geralmente não são funcionais. Além disso, muitas proteínas se tornam insolúveis como corpos de inclusão que são difíceis de recuperar sem desnaturantes agressivos e subsequente redobramento de proteínas.

Para abordar essas preocupações, foram desenvolvidos sistemas de expressões usando várias células eucarióticas para aplicações que exigem que as proteínas sejam conformadas como em organismos de eucariotos ou mais próximos deles: células de plantas (i.e. tabaco), de insetos ou mamíferos (i.e. bovinos) são transfectados com genes e cultivados em suspensão e até como tecidos ou organismos inteiros, para produzir proteínas totalmente dobradas. Sistemas de expressão de mamíferos in vivo têm, no entanto, baixo rendimento e outras limitações (tempo de consumo, toxicidade para as células hospedeiras,..). Para combinar as características de alto rendimento / produtividade e proteínas escalonáveis de bactérias e leveduras e as características epigenéticas avançadas dos sistemas de plantas, insetos e mamíferos, outros sistemas de produção de proteínas são desenvolvidos usando eucariotos unicelulares (i.e. células 'Leishmania' não patogênicas).

Sistemas bacterianos[editar | editar código-fonte]

Escherichia coli[editar | editar código-fonte]
E. coli, um dos hospedeiros mais populares para expressão de genes artificiais.

E. coli é um dos hospedeiros de expressão mais usados, e o DNA é normalmente introduzido em um vetor de expressão plasmídeo. As técnicas para sobre-expressão em E. coli são bem desenvolvidos e funcionam aumentando o número de cópias do gene ou aumentando a força de ligação da região promotora, ajudando na transcrição.

Por exemplo, uma sequência de DNA para uma proteína de interesse pode ser clonada ou subclonada em um plasmídeo com alto número de cópias contendo o promotor lac (geralmente LacUV5), que é então transformado na bactériaE. coli. A adição de IPTG (um análogo da lactose) ativa o promotor lac e faz com que as bactérias expressem a proteína de interesse.

As cepas de E. coli BL21 e BL21 (DE3) são duas cepas comumente utilizadas para a produção de proteínas. Como membros da linhagem B, eles carecem de proteases lon e OmpT, protegendo as proteínas produzidas da degradação. O profago DE3 encontrado em BL21 (DE3) fornece T7 RNA polimerase (acionado pelo promotor LacUV5), permitindo que vetores com o promotor T7 sejam utilizados.[14]

Corynebacterium[editar | editar código-fonte]

Espécies não patogênicas das Corynebacterium gram-positivas são usados para a produção comercial de vários aminoácidos. As especies de C. glutamicum são usadas amplamente para produzir glutamato e lisina,[15] componentes de alimentos humanos, alimentos para animais e produtos farmacêuticos.

Expressão de fator de crescimento epidérmico humano funcionalmente ativo tem sido produzido em C. glutamicum,[16] demonstrando assim um potencial para produção em escala industrial de proteínas humanas. As proteínas expressas podem ser direcionadas para secreção através tanto da geral, via secretora (Sec) ou da via de translocação de arginina dupla (Tat).[17]

Ao contrário das bactérias gram-negativas, os Corynebacterium gram-positivos não possuem lipopolissacarídeos que funcionam como endotoxinas antigênicas em humanos.

Pseudomonas fluorescens[editar | editar código-fonte]

A bactéria não patogênica e gram-negativa, Pseudomonas fluorescens, é usado para produção de alto nível de proteínas recombinantes; comumente para o desenvolvimento de bio-terapêuticas e vacinas. P. fluorescens é um organismo metabolicamente versátil, permitindo triagem de alto rendimento e rápido desenvolvimento de proteínas complexas. P. fluorescens é mais conhecido por sua capacidade de produzir rapidamente e com sucesso altos títulos de proteína solúvel ativa.[18]

Sistemas eucarióticos[editar | editar código-fonte]

Leveduras[editar | editar código-fonte]

Sistemas de expressão usando tanto S. cerevisiae como Pichia pastoris permite a produção estável e duradoura de proteínas que são processadas de maneira semelhante às células de mamíferos, com alto rendimento, em meios quimicamente definidos de proteínas.

Ver também[editar | editar código-fonte]

Referências

  1. ↑ Gräslund S, Nordlund P, Weigelt J, Hallberg BM, Bray J, Gileadi O, Knapp S, Oppermann U, Arrowsmith C, Hui R, Ming J, dhe-Paganon S, Park HW, Savchenko A, Yee A, Edwards A, Vincentelli R, Cambillau C, Kim R, Kim SH, Rao Z, Shi Y, Terwilliger TC, Kim CY, Hung LW, Waldo GS, Peleg Y, Albeck S, Unger T, Dym O, Prilusky J, Sussman JL, Stevens RC, Lesley SA, Wilson IA, Joachimiak A, Collart F, Dementieva I, Donnelly MI, Eschenfeldt WH, Kim Y, Stols L, Wu R, Zhou M, Burley SK, Emtage JS, Sauder JM, Thompson D, Bain K, Luz J, Gheyi T, Zhang F, Atwell S, Almo SC, Bonanno JB, Fiser A, Swaminathan S, Studier FW, Chance MR, Sali A, Acton TB, Xiao R, Zhao L, Ma LC, Hunt JF, Tong L, Cunningham K, Inouye M, Anderson S, Janjua H, Shastry R, Ho CK, Wang D, Wang H, Jiang M, Montelione GT, Stuart DI, Owens RJ, Daenke S, Schütz A, Heinemann U, Yokoyama S, Büssow K, Gunsalus KC (Fevereiro de 2008). «Protein production and purification». Nature Methods. 5 (2): 135–46. PMC 3178102Acessível livremente. PMID 18235434. doi:10.1038/nmeth.f.202 
  2. ↑ Baneyx F (Outubro 1999). «Recombinant protein expression in Escherichia coli». Current Opinion in Biotechnology. 10 (5): 411–21. PMID 10508629. doi:10.1016/s0958-1669(99)00003-8 
  3. ↑ Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (Setembro 2000). «Recombinant protein expression in Pichia pastoris». Molecular Biotechnology. 16 (1): 23–52. PMID 11098467. doi:10.1385/MB:16:1:23 
  4. ↑ a b Malys N, Wishart JA, Oliver SG, McCarthy JE (2011). Protein production in Saccharomyces cerevisiae for systems biology studies. Methods in Enzymology. 500. [S.l.: s.n.] pp. 197–212. ISBN 9780123851185. PMID 21943899. doi:10.1016/B978-0-12-385118-5.00011-6 
  5. ↑ Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL (Maio 2005). «Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells». Nature Biotechnology. 23 (5): 567–75. PMC 3610534Acessível livremente. PMID 15877075. doi:10.1038/nbt1095 
  6. ↑ Rosser MP, Xia W, Hartsell S, McCaman M, Zhu Y, Wang S, Harvey S, Bringmann P, Cobb RR (Abril 2005). «Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system». Protein Expression and Purification. 40 (2): 237–43. PMID 15766864. doi:10.1016/j.pep.2004.07.015 
  7. ↑ Lackner A, Genta K, Koppensteiner H, Herbacek I, Holzmann K, Spiegl-Kreinecker S, Berger W, Grusch M (Setembro 2008). «A bicistronic baculovirus vector for transient and stable protein expression in mammalian cells». Analytical Biochemistry. 380 (1): 146–8. PMID 18541133. doi:10.1016/j.ab.2008.05.020 
  8. ↑ Visser H, Joosten V, Punt PJ, Gusakov AV, Olson PT, Joosten R, et al. (Junho 2011). «Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1». Industrial Biotechnology. 7 (3): 214–223. doi:10.1089/ind.2011.7.214 
  9. ↑ Wang, Xing; Hunter, Alan K.; Mozier, Ned M. (15 de junho de 2009). «Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment». Biotechnology and Bioengineering (em inglês). 103 (3): 446–458. ISSN 0006-3592. PMID 19388135. doi:10.1002/bit.22304 
  10. ↑ «Definition: expression system». Online Medical Dictionary. Centre for Cancer Education, University of Newcastle upon Tyne: Cancerweb. 13 de novembro de 1997. Consultado em 10 de junho de 2008 
  11. ↑ «Expression system - definition». Biology Online. Biology-Online.org. 3 de outubro de 2005. Consultado em 10 de junho de 2008 
  12. ↑ «overexpression». Oxford Living Dictionary. Oxford University Press. 2017. Consultado em 18 Maio 2017. "The production of abnormally large amounts of a substance which is coded for by a particular gene or group of genes; the appearance in the phenotype to an abnormally high degree of a character or effect attributed to a particular gene." Tradução: A produção de quantidades anormalmente grandes de uma substância que é codificada por um gene ou grupo de genes específico; a aparência no fenótipo para um grau anormalmente alto de um caractere ou efeito atribuído a um gene em particular. 
  13. ↑ «overexpress». NCI Dictionary of Cancer Terms. National Cancer Institute at the National Institutes of Health. 2 de fevereiro de 2011. Consultado em 18 Maio 2017. overexpress
    "In biology, to make too many copies of a protein or other substance. Overexpression of certain proteins or other substances Maio play a role in cancer development." Tradução: Em biologia, para fazer muitas cópias de uma proteína ou outra substância. A superexpressão de certas proteínas ou outras substâncias pode desempenhar um papel no desenvolvimento do câncer.     
  14. ↑ Jeong, H; Barbe, V; Lee, CH; Vallenet, D; Yu, DS; Choi, SH; Couloux, A; Lee, SW; Yoon, SH; Cattolico, L; Hur, CG; Park, HS; Ségurens, B; Kim, SC; Oh, TK; Lenski, RE; Studier, FW; Daegelen, P; Kim, JF (11 Dezembro 2009). «Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).». Journal of Molecular Biology. 394 (4): 644–52. PMID 19786035. doi:10.1016/j.jmb.2009.09.052 
  15. ↑ Brinkrolf K, Schröder J, Pühler A, Tauch A (Setembro 2010). «The transcriptional regulatory repertoire of Corynebacterium glutamicum: reconstruction of the network controlling pathways involved in lysine and glutamate production». Journal of Biotechnology. 149 (3): 173–82. PMID 19963020. doi:10.1016/j.jbiotec.2009.12.004 
  16. ↑ Date M, Itaya H, Matsui H, Kikuchi Y (Janeiro 2006). «Secretion of human epidermal growth factor by Corynebacterium glutamicum». Letters in Applied Microbiology. 42 (1): 66–70. PMID 16411922. doi:10.1111/j.1472-765x.2005.01802.x 
  17. ↑ Meissner D, Vollstedt A, van Dijl JM, Freudl R (Setembro 2007). «Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria». Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (3): 633–42. PMID 17453196. doi:10.1007/s00253-007-0934-8 
  18. ↑ Retallack DM, Jin H, Chew L (Fevereiro 2012). «Reliable protein production in a Pseudomonas fluorescens expression system». Protein Expression and Purification. 81 (2): 157–65. PMID 21968453. doi:10.1016/j.pep.2011.09.010 
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